卟啉人血清白蛋白的多波长分析超细分析

内容类型:应用笔记
Tourly N. Johnson |Uthscsa,生物化学部和结构生物学,圣安东尼奥,德克萨斯州
海蒂·拉莫斯|UTSA,物理和天文学部,圣安东尼奥,德克萨斯州
Julio Urquidi | UTSA,物理和天文系,圣安东尼奥,德克萨斯州
Lorenzo Brancaleon |UTSA,物理和天文学部,圣安东尼奥,德克萨斯州
Borries Demeler |Uthscsa,生物化学部和结构生物学,圣安东尼奥,德克萨斯州

抽象的

分析超速离心(AUC)是在生理溶液条件下表征胶体系统的选择方法。最近,Beckman Coulter的新型多波长(MWL)探测器新利国际娱乐Optima AUC首次将胶体混合物的流体动力分离与混合物中相互作用和非相互作用溶质的光谱反褶积相结合。我们在这里展示了如何利用in Sorét带卟啉与不同阳离子络合的优势,从不同分子的不同光学性质频谱反涡。人类血清白蛋白(HSA)的几个位点被假定具有直接结合金属离子和有机金属化合物的能力。这一证据引发了人们对HSA作为金属结合蛋白的生理作用以及作为金属结合特性(例如,合成血液和太阳能转换)的合成生物学用途的载体的兴趣。在这些相互作用中,最引人入胜和潜在有用的是HSA结合血红素和其他金属卟啉的能力。我们在这里展示了Optima AUC上的mwh -AUC如何基线分离HSA-PPIX和apo-HSA之间水动力形状和大小的微小变化。

方法

HSA-PPIX的结合与纯化

人血清白蛋白(HSA)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。氯化锡(Sn(IV) PPX)购自Frontier Scientific Inc. (Logan, UT)。固态Sn(IV)PPIX溶于DMSO中。然后将其稀释,形成含有<1% DMSO的水原液。将人血清白蛋白(HSA)加入到水溶液中,然后进行透析,随后离心,形成无聚集的溶液。1/

紫外光谱法

在台式分光光度计上测量与卟啉络合的Apo-HSA和HSA的UV /可见光光谱。在Sorét带上在370-420nm之间的Sorét带上最大吸收卟啉。HSA的最大吸收是〜278nm(参见图1)。1使用实际值来确定每个样品中HSA和单体化卟啉的浓度。

图1.人血清(HSA),HSA + PPIX-SN和HSA + PPIX-Zn的吸光度谱 图2。测量波长图(绿色圆圈)。波长的选择强调了光谱中吸光度变化最大的区域。
图1:人血清(HSA)、HSA+PPIX-Sn和HSA+PPIX-Zn的吸收光谱 图2:测量波长图(绿色圆圈)。波长的选择强调了光谱中吸光度变化最大的区域。

分析超速离心法

沉淀速度实验以45000rpm和20℃进行。将样品置于配有EPON中心件和石英窗口的细胞中。在10mM NaPO 4缓冲液中测量另外的样品。使用配备有吸光度和瑞利干扰光学器件的新Beckman Optima Auc多波长仪进行实验。在强度模式下测量42波长。定位波长以确保光谱的线性插值将产生内插和测量光谱之间的最小RMSD差异。这种方法强调吸光度迅速变化的光谱区域。在10.5小时内为每个波长收集45扫描。

AUC-MWL数据分析

所有数据均采用UltraScan-III版本2352进行分析。2通过定义每个波长的弯月面、数据范围和平台来编辑沉降速度数据。采用二维频谱分析(2DSA)拟合半月板3.,同时减去时不变噪声和径向不变噪声。最后进行迭代2DSA步骤。使用最后2 dsa模型对于每一个波长,每个波长的计算时间同步有限元模型,生成一个表面多(见图3、4)。结果模拟分解成光谱向量基础为每个幽灵似地独特的组件生成一个新的数据集(见方程(1)。4

方程1。通过将波长剖面分解为代表HSA和HSA- ppix - sn的本征吸收光谱的2个基向量,得到了多波长数据集的非负最小二乘
方程1:通过将波长剖面分解为代表HSA和HSA- ppix - sn的本征吸收光谱的2个基向量,得到了多波长数据集的非负最小二乘

该方法将为每个光谱唯一部件的每个径向位置和扫描时间产生标量浓度,导致每个光谱唯一物种的单独的流体动力学实验数据。在这种情况下,我们使用APO-HSA和HSA-PPIX-SN的吸光度光谱将信号分离成两个光谱不同的流体动力学数据集。通过Monte Carlo分析分析了这些数据集5使用2DSA或参数约束谱分析(PCSA)。6水动力学曲线作为波长的函数可以揭示每个物种的光谱特性7如图5所示。

图3。第25次扫描的时间同步有限元模型 图4.时间同步有限元模型的第50次扫描
图3:第25次扫描的时间同步有限元模型 图4:时间同步有限元模型的第50次扫描

图5.流体动力学性能作为光谱特性的波长的函数
图5:作为光谱性能的波长的函数的流体动力学性质

结果

本研究的目的是鉴定纯化的HSA- ppix是否可以通过多波长使能的AUC可靠地从游离的HSA中区分出来8.为此,我们将apo-HSA与之前制备的HSA-PPIX-Sn复合物混合。分离的流体动力数据集的蒙特卡罗分析结果如图6所示。这些结果表明,将信号分离成两个不同的水动力数据集,使我们能够确定浓度和水动力参数的频谱独特的溶液组分。这些结果还表明,卟啉络合HSA的沉降系数略高于apo-HSA。

图6.单波长(278nm)实验(左)显示两个峰,但是由这些峰表示的物种无法辨别。 多波长实验(右)允许我们基线分离每个组分。这使我们能够分辨出哪个峰代表apo-HSA(红色),哪个峰代表HSA-PPIX-Sn复合物(蓝色)。
图6:一个单一波长(278 nm)的实验(左)显示了两个峰,但这些峰所代表的物种无法被识别。多波长实验(右)允许我们基线分离每个组分。这使我们能够分辨出哪个峰代表apo-HSA(红色),哪个峰代表HSA-PPIX-Sn复合物(蓝色)。

自由HSA和与PPIX结合的HSA的吸光度谱的差异可以用来将水动力数据分离成代表这两种物质的数据集。从图6中可以看出,即使它们在水动力上非常相似,这种方法也可以将单个物种的光谱分离能力基线分离,而单个波长(278 nm,即apo-HSA的吸光度峰)显示为两个峰,虽然尚不清楚哪一种代表apo HSA,哪一种代表HSA- ppix - sn。这使得任何AUC实验的分辨率都比以前高得多。此外,对于含有多个具有不同吸收光谱的物种的混合物,如果它们在流体动力学上很好地分离(见图5和图6),现在就可以得到每个物种的固有消光光谱。混合物中存在的两种物种在流体动力学上非常相似,独特的光谱很难辨别(图5)。显然,这种改进对AUC实验的未来有着深远的影响,特别是对相互作用伙伴具有独特光谱特性的相互作用系统的研究。

参考

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